Серийный выпуск самолета, начатый в 1934 году, по настоящему развернулся только на следующий год. Даже те И-16, которые были выпущены и засчитаны в производственный план 1934 года, продолжали доводиться и в 1935 году. Тогда же появилась возможность устанавливать на самолет двигатели М-25, являющиеся советской копией американского «Райт-Циклон» Ф-3.

Производство этих двигателей развернули на вновь построенном авиазаводе №19 в городе Пермь, на Урале. За 1935 год, используя зачастую американские детали, завод выпустил 660 двигателей М-25. Часть этих двигателей предназначалась для И-16. Новая модификация самолета уже была построена в Москве, пять первых машин этого типа вошли в «красную пятерку», а самолет №54 (№ 123954), выпущенный 25 апреля 1935 года подвергся тщательным заводским испытаниям. Имея полетный вес 1432 килограмма, он развивал скорость на трехкилометровой высоте 456 км/час. В целом этот И-16 очень напоминал третий опытный экземпляр с «Райт-Циклоном» Ф-3, однако капот двигателя несколько изменился и получил лобовые жалюзи, элеронная щель была заделана. а клапаны-обтекатели вдоль всего размаха оперения сменились маленькими крышками на узлах навески рулей. На серийном заводе №21 в Нижнем Новгороде этот самолет получил обозначение тип 5.

К моменту внедрения этой модификации в серийное производство, заводской коллектив уже вполне освоился с выпуском И-16, а серийный конструкторский отдел (СКО) уже проводил свои удачные доработки машины. Еще в конце 1934 года заводские конструкторы разработали свой вариант убирающегося шасси. Проведенные испытания на первом же заводском И-16 №4211, показали, что механизм работает вполне надежно, поэтому на всех последующих выпускаемых машинах ставилась эта кинематика. Довели к тому времени, то есть к моменту выпуска машины тип 5 и вооружение самолета. Характерной особенностью И-16 было его изначальное вооружение новейшим пулеметом ШКАС калибра 7,62 мм. Этот пулемет, разработанный в 1932 году оружейниками Шпитальным и Комарицким, обладал самой высокой в мире скорострельностью — 1800 выстрелов в минуту. ШКАС был запущен в серийное производство одновременно с И-16 в 1934 году и первоначально сам обладал многочисленными дефектами, которые приходилось устранять уже в процессе эксплуатации самолета. Хотя новый пулемет был дороже в пять раз (в 1934 году его цена была определена в 5000 рублей) освоенного промышленностью ПВ-1 (Максим), по весу он был в полтора раза легче, а по скорострельности стоил двух старых пулеметов.

Первоначально ШКАСы, установленные в крыльях, давали при стрельбе много отказов. Причина заключалась в том, что конструкторы самолета установили пулемет в перевернутом положении — так оказалось удобнее его конструктивно увязать. Хитрая механика, находясь вверх ногами, стала заедать, оружейники, опомнившись, стали протестовать, однако дело было сделано и первые И-16 выпуска 1934 года так и летали с капризным вооружением. Впоследствии этот недостаток естественно был устранен.

В период с 28 августа по 3 ноября 1935 года 10 самолетов И-16 выпуска завода №39 проходили войсковые испытания в 107 авиаэскадрилье Брянской авиабригады. Военные летчики изучали все слабые и положительные стороны самолета, все возможные варианты его боевого применения. Выяснилось, например, что опускаемые на взлете элероны (И-16 тип 4 и тип 5 обладали механизмом дифференциального опускания элеронов, в таком виде они осуществляли функцию закрылков) действительно ощутимо сокращают дистанцию взлета и посадки. Это заключение было весомым аргументом для сторонников И-16, ибо работы по расширению действующих аэродромов для новых истребителей только велись.

В оценке пилотирования говорилось, что «управление самолетом легкое, чувствительно реагирует на малейшее движение рулей, …малейших ошибок не прощает. …Передирание ручки на вираже и посадке опасно сваливанием в штопор». Такая высокая чувствительность самолета на малейшие движения ручки управления затрудняла пользование гашетками пулеметов, оснащенных механическим спуском — требовался более мягкий электроспуск. Бочку И-16 крутил за 1-1,2 секунды, причем самолет всегда можно было зафиксировать и в промежуточном положении. Отметили армейские пилоты (как и несколько ранее испытатели), что при полетах на максимальной скорости верхняя обшивка крыльев отсасывается потоком и как бы вспучивается. Частоту нервюр явно необходимо было увеличить — впрочем, конструкторы к этому времени уже разрешили этот вопрос.

Особое внимание было уделено проведению штопора. Вот основные оценки: «Самолет штопорит хорошо на всех высотах… в процессе штопора, при ослабленной ноге, заметна, после каждого витка, тенденция самолета выйти из штопора. …Правый штопор проводится до 12 витков без запаздывания при выводе. Штопор влево происходит энергичнее… ввод и вывод как в правый, но полного добора ручки не желательно, так как в этот момент самолет поднимает нос между горизонтом и нормальным штопором, вращение происходит плоское, а вывод с запаздыванием — после пяти витков два витка запаздывания, …случаев отказа управления при штопоре не было». Общая оценка самолета гласила: «Обладает отличными пилотажными качествами». В том же 1935 году И-16 впервые отправился за границу. На миланской международной авиационной выставке в Италии Советский Союз выставил несколько образцов самолетов: АИР-9 бис Яковлева, ОСГА-101 Четверикова, Сталь-3 Путилова. Ярко раскрашенный И-16 представлялся как спортивный самолет АСБ с максимальной скоростью 467 км/час. По сравнению с длинными, вытянутыми гоночными машинами выглядел он скромно и вызывал на выставке скорее недоумение чем неописуемый восторг. Мало кто думал тогда, что русские всерьез намерены развернуть крупномасштабное производство этого толстячка. А устроители выставки, пожалуй, меньше всех подозревали, что через год с небольшим от него крепко достанется, прежде всего, итальянским конструкциям.
Во время гражданской войны в Испании в 1936-1939 гг. И-16 впервые был использован в боевой обстановке. Истребители были получены испанской республикой из Советского Союза в конце октября, начале ноября 1936 года. Это была первая партия поставленных машин, состоящая из 31-го И-16 тип 5. Вместе с самолетами прибыли летчики 1-ой авиабригады из Брянска. Группой этих пилотов, состоящей из 3-х эскадрилий, командовал капитан Тархов. Уже 9-го ноября 1936 года И-16 впервые появились в небе над Мадридом. Появление И-16 коренным образом изменило характер воздушных схваток. Новый боец был первым в мире самолетом способным вести бои на вертикали. Основные противники — немецкий истребитель He-51 и итальянский C.R.32 значительно уступали ему по своим летным данным — настолько, что пилотам этих машин было настоятельно не рекомендовано ввязываться в бой, не имея численного преимущества. Это было уже излишним. Ужас встречи с внезапно появившимися И-16, у националистов первоначально был столь велик, что они дали ему прозвище «Рата» (крыса). Республиканцы стали ласково называть своего защитника «Моска» (муха), а авиационные издания всего мира окрестили «Боингом», утверждая при этом, что самолет разработан на этой известнейшей американской фирме.